肌肉外伤切断周围神经后，完全重新支配可能需要数年时间。在此期间，失去神经支配的肌肉会萎缩并失去乙酰胆碱受体（神经肌肉接头的重要组成部分），从而限制了功能的恢复。临床上治疗肌肉萎缩的常用方法之一是电刺激，但目前使用的附膜电极体积庞大，而且经常会因过度炎症反应而失效。此外杠杆资本分配线上，仍然需要一种能在体内监测神经肌肉再生和乙酰胆碱受体维持情况的装置。在此，我们开发了一种可植入的柔性微电极阵列（MEA），它能在长期神经支配过程中提供表面神经肌肉刺激和记录。

MEA 使用柔性聚酰亚胺弹性体和具有 Peano 曲线图案的金基微电极阵列，共同保持电极的柔性。这些装置被植入 5 只大鼠的去神经支配腓肠肌。这些大鼠从术后第 2 天开始每天接受 MEA 治疗性刺激。另外 5 只大鼠接受了胫神经切除术，但没有植入 MEA。术后第 14 天收获组织，并使用免疫荧光和组织学染色对乙酰胆碱受体和肌纤维面积进行量化评估。该装置植入大鼠体内后成功记录了肌电图数据。与未经治疗的去神经支配肌肉相比，MEA疗法通过维持更大的肌肉纤维横截面积，减轻了肌肉萎缩（p < 0.05）。这项概念验证工作成功证明了将适形性、抗拉强度增强金属微图案化、电刺激和记录结合到功能性植入物中的能力，该植入物既可用于附肌刺激，也可用于记录。

一、研究简介

硅是所有电子产品的基本平台，自 1947 年第一个晶体管问世以来，硅的刚性一直阻碍着修复仿生学的发展。坚硬电极与软组织之间的机械不匹配会导致植入部位出现聚集性炎症。由此产生的纤维组织可能会将装置与下层组织隔离开来，从而限制电流在记录和刺激过程中的有效传输。理想的电极应由柔性材料组成，这种材料对拉伸具有低模量响应，可产生更大的弹性变形，并能使移动组织与电极紧密接触。柔性电子产品已被开发用于电子皮肤、电子纺织品和柔性太阳能电池 。这类产品由沉积在聚合物基底上的金属膜组成。硅、聚酰亚胺（PI）、SU-88、对二甲苯C9 和聚二甲基硅氧烷（PDMS）10 的杨氏模量分别约为 25.5 GPa、8.45 GPa、5.6 GPa、4.0 GPa 和 1.0 MPa。因此，与硅基电极相比，使用聚合物基底的电极对组织的损伤较小。之所以选择 PI 作为基底，是因为它具有多种形状和相对温和的异物反应，这两点对于可拆卸、非永久性植入物非常有用。这种材料已被广泛用于神经表面界面。科学家设计了在厚度约为 12 μm 的 PI 基底上制造的带有金碳纳米管的 C 形袖带电极，以最小的接触创建神经-电极界面，从而减少神经损伤。

虽然这些聚酰亚胺电极具有柔韧性，但其局限性在于作为导电层嵌入聚酰亚胺基底的金属元件（包括金、不锈钢、铂、钛和铱）会产生硬化效应。在最近的一项研究中，硬金属线被设计成分形图案（图 1A 和 1B），并粘合到弹性体上以提高伸展性。Peano 曲线是一种连续且充满空间的分形曲线。这种设计可用于微电子布线，并提供多轴支持。图 1C 所示的这种 Peano 图案变化被用于我们设备的布线，将接触垫连接到源平台（图 1D）。

图 1：（A）分形图案的基本元素。(B) 用弧线代替了硬边，形成轮廓。(C) Peano 曲线变化显示了具有拉伸强度的硬金属痕迹。(D）电极阵列皮纳曲线。(E) 柔性微电极阵列（MEA），包括一个 1 厘米乘 1 厘米大小的源平台。(F) 金培诺曲线电极的扫描电子显微镜图像。(G) 设备组件示意图。

植入式微电极阵列（MEA）的开发是为了在周围神经损伤后对肌肉进行电刺激，在这种情况下，骨骼肌的神经被切断并发生沃勒变性。被切断的神经以每天 2-3 毫米的速度再生，大约需要一年时间才能愈合。即使对周围神经损伤进行了最佳的药物和手术治疗，肌肉功能也只能得到部分恢复。这种不完全恢复是由于神经肌肉接头（NMJ）的解体导致再生神经无法建立适当的肌肉-神经界面。NMJ 由三个部分组成，包括运动轴突末端、末端许旺细胞和含有乙酰胆碱受体（AChR）的肌纤维终板。周围神经损伤一周后，乙酰胆碱受体簇会分散，乙酰胆碱受体的周转时间缩短十倍，导致可用于再支配的乙酰胆碱受体数量明显减少。因此，再神经支配只能恢复有限的功能。

在此，我们将介绍我们如何努力设计一种装置来防止肌肉萎缩和乙酰胆碱受体降解，以改善后续的再神经支配并缩短康复时间。为了更好地将电子器件与人体柔软的骨骼肌组织相结合，我们开发了三种主要方法。首先，将金线印在一层柔性生物相容性材料 PI 上，制成弹性电路板。除了提供电气平台，聚酰亚胺材料还能起到电绝缘作用（图 1E 和 1G）。其次，两个电极以并排平行的形式重新排列，可以适应弯曲的表面。最后，受大自然的启发，电路布线被重新设计成分形模式，允许多向拉伸。

二、研究材料与方法

2.1 MEA 的制造

图 S1 报告了器件制造过程的概要。制造过程从直径 100 毫米的无尘硅片（测试 N 型，<100>）开始，该硅片被用作制造平台。2) 在平台上以 5000 rpm 的转速旋涂一层 200 nm 的聚甲基丙烯酸甲酯，持续 60 秒。4) 使用电子束沉积法在平台上沉积 10 纳米钛（Ti）附着层和 500 纳米金（Au）层。5) 在平台上旋涂一层 6 μm 的 Microposit s1813 光刻胶，转速为 1,500 rpm，时间为 30 秒，然后在 100° C 下固化 3 小时。7) 使用碘化钾溶液蚀刻金层 278 秒。将平台浸入酸性罩内的溶液中 280 秒。在酸性罩内使用 10:1:1 的去离子水/氟化氢/过氧化氢溶液对钛粘附层进行 10 秒钟的蚀刻。8) 以 2,700 rpm 的转速旋转涂覆 10 μm 的 PI 封装层 30 秒，然后在 250° C 下固化 2 小时。） 在反应离子蚀刻过程中，沉积 2 nm 的铝层以保护接触垫位置周围的聚酰亚胺。10) 在 5000 rpm 的转速下旋涂一层 6 μm 的 Microposit s1813 光阻 60 秒，然后在 100° C 下固化 3 小时。11) 铝层在 50 摄氏度的酸性罩中蚀刻 2 秒钟。12) 利用 100% 氧气进行活性离子蚀刻。12) 其余的铝层在 50° C 的酸性罩中蚀刻 2 秒钟。13) 使用丙酮溶解 PMMA 底座，然后将装置从平台上拆下。然后将电极切割成 1 厘米乘 1 厘米的正方形。

2.2 手术植入

所有动物实验程序均按照美国陆军医学研究和物资司令部（USAMRMC）研究保护办公室（ORP）和麻省理工学院动物护理委员会（Committee on Animal Care of Massachusetts Institute of Technology）的动物护理和使用审查办公室（ACURO）的指导方针进行，实验对象为雌性 Lewis 大鼠（n = 10，年龄：14 周）。所有装置均在植入前用环氧乙烷灭菌，并至少脱气 24 小时。皮下注射以下剂量的预防性镇痛药：布仑奈斯（0.03 毫克/千克）和美洛昔康（1.0 毫克/千克）。所有手术均在异氟醚（2.0%）/氧气吸入条件下进行。所有手术均在无菌环境中采用无菌技术进行。平行于股骨切开一个 2 厘米的切口。通过股外侧肌和股二头肌进行钝性剥离，显露后窝内的坐骨神经。胫神经被确定为最大和最中心的分支。用虹膜剪刀尽可能向远端切除该神经（图 S8A），并在近端再进行不小于 1.5 厘米的锐性切除。从后窝取出 1.5-3 厘米的部分（图 S8B）。然后使用四针聚丙烯缝线将装置固定在腓肠肌上。连接 MEA 的导线穿过皮下隧道到达头皮切口。用牙科陶瓷将与线束末端相连的头架安装在头骨上。对动物进行监护，直到其恢复意识。术后 14 小时进行术后检查。手术后每隔8小时给动物注射一次布普利昔（0.03毫克/千克），用于止痛。美洛昔康（1.0毫克/千克）每24小时给药一次，持续48小时。动物在手术后14天安乐死。

2.3 组织学

手术 14 天后采集组织样本。样本在磷酸盐缓冲液（PBS）中的 4% 福尔马林溶液中固定 24 小时。然后，将样本放入 70% 的乙醇（用超纯密理博水作为稀释剂）中，并送至科赫研究所组织学核心，用石蜡固定。从每个石蜡块中取出厚度为 5 微米的多片腓肠肌轴向切片，固定在显微镜载玻片上，并用血红素和伊红（H&E）、梅森三色染色（MTS）和皮克天狼星红（PSR）染色，以分析肌肉纤维面积，并评估大体形态变化和胶原沉积。每个石蜡切片块中厚度为 5 µm 的其他轴向切片被固定，并用 Alexa-Flour 488 连接的 alpha bungarotoxin 染色，然后用 DAPI 反染。

2.4 体内功能性电刺激

通过板载无线蓝牙客户端的 rFDuino 微控制器（图 2a），电输入导线与 MEA 的输出导线相连。我们创建了一个 iPhone 应用程序，通过 Arduino 集成开发环境 (IDE) 代码控制振幅、频率和间隔长度。利用 Arduino 集成开发环境，我们能够为功能性电刺激预先编程所需的参数，并将其上传到 rfDuino 微控制器。由于 rfDuino 由小型低功耗纽扣电池（CR2032 锂金属 3V 250mAh 纽扣电池）供电，因此可以启动 BLE 堆栈。我们使用 XCode 系统将 iPhone 与 rfDuino 通过蓝牙配对；配对成功后，手机将充当控制器，控制微控制器的预编程参数。按下手机上的按钮后，二进制输入数据就会以无线方式发送到微控制器，微控制器就会按照所需的参数开始刺激程序。系统按设定的编程时间间隔从低功耗纽扣电池中获取必要的电流，并将其输出到 MEA。rfDuino 与 MEA 之间的连线使用的是细长的医用不锈钢绞合线。电流通过 MEA，然后从与组织连接的小接触片中流出。

图 2：（A）刺激的持续时间、电压和频率由手机应用程序和带有蓝牙客户端的 rFDuino 微控制器控制。共有 10 只动物接受了胫神经损伤手术，其中 5 只植入了电极。术后第 14 天（POD 14），收获腓肠肌进行组织学和免疫组化染色。(B) H&E 和梅森三色染色法（MTS）染色的肌肉纤维的 2 倍和 10 倍放大截面图：（1）未受刺激的去神经支配肌肉（上图，“去神经支配，无 MEA”）；（2）受 MEA 刺激的去神经支配肌肉的肌肉纤维（中图，“去神经支配 + MEA”）；（3）未受刺激的神经支配肌肉的肌肉纤维（下图，“对照组”）。C) 测量 “对照组”（左）、“去神经支配”（无 MEA，中）和 “去神经支配 + MEA”（右）的肌纤维横截面积。通过 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn's 多重比较后检验，误差条数为 ± S.E.M.，* 表示 p < 0.05。在对照组（神经支配的腓肠肌）病例中，测量了 5 只动物的 1600 根纤维。在未受 MEA 刺激的 5 只腓肠肌去神经支配动物中，测量了 8 只动物的 1600 根纤维。对于 MEA 病例，从 5 只动物身上测量了 955 根纤维。肌肉纤维面积以任意单位（AU）表示。(D）未受刺激和受刺激肌肉的 AChR 平均面积。刺激情况下的面积明显更大。误差带为 ± S.E.M.，* 表示经曼-惠特尼检验 p < 0.05。在 5 只未受刺激的去神经支配腓肠肌动物中，共采集了 3160 个读数。在 5 只接受 MEA 刺激的去神经支配腓肠肌动物中，共采集了 2697 个读数。面积以任意单位（AU）报告。

2.5 体内外膜记录

用异氟醚（2%）/氧气吸入法麻醉一只 Lewis 大鼠。沿股骨长度的一半切开。在股外侧肌/股二头肌平原之间的脂肪垫处进行钝性剥离，显露坐骨神经。然后分离坐骨神经，用钩状神经刺激器将其抬起 2 厘米，以避免与肌肉接触。

钩状神经电极连接到 S88X 型草刺激器上。草刺激器被设置为输出 400 毫秒的双相序列，每相脉冲宽度为 200 微秒。振幅扫描用于确定 MEA 是否能够通过增加每个脉冲序列的信号振幅来捕捉电信号的变化。记录在三个连续的脉冲串上进行。来自刺激器的受控电流流向钩状神经电极，以刺激离体坐骨神经。MEA 设备连接到 RHD2000 系列放大器评估系统（Intan Technologies），该系统可记录多达 256 个低噪声放大器通道的生物电位信号（图 3A）。MEA 被平放于股二头肌背侧表面，以便远离坐骨神经进行理想的肌肉接触。此外，还在皮下插入了一个接地电极，以提供导电通道。

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图 3. (A) MEA 设备连接到 RHD2000 系列放大器评估系统（Intan Technologies）。RHD2000 芯片将 EMG 信号输出到计算机，在计算机上使用 MATLAB 对数据进行处理。MEA 平放在股二头肌表面的顶部，以便远离坐骨神经的理想肌肉接触。肌肉内插入接地电极，为导电提供通道。(B) 图中显示的是一只动物植入电极后立即进行的代表性肌电图，包括所有后处理步骤，以展示 MEA 在直接刺激坐骨神经时记录三组脉冲刺激的能力。

2.6 统计分析

未对 H&E 图像或显微镜图像进行预处理。所有肌纤维横截面积数据（图 S3 和 S4）和乙酰胆碱受体面积数据（图 S5 和 S6）的 Q-Q 图显示为非正态分布。Shapiro-Wilk 检验进一步证实了这种非高斯分布。由于缺乏正态性，因此无法使用参数统计分析（即学生 t 检验和方差分析）。为了比较两个均值，使用了非参数独立组曼-惠特尼检验。若要比较两个以上的独立组，则采用非参数 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn's 多重比较后检验。如果 p < 0.05，则认为差异具有统计学意义。统计测试使用 GraphPad Prism 5.00 版和 R 3.4.3 版进行。

三、研究结果

3.1 柔性多电极阵列（MEA）的机械测试

还对 MEA 进行了机械测试，以确定其在模拟体内压力下的弹性特性。MEA 与下层肌肉和肌腱组织之间的模量匹配对于预防植入创伤、微动损伤和植入部位炎症引起的许多急性和慢性问题非常重要。

如图 S2 所示，在伸长率为 20% 时，MEA 在失效前可承受高达 5.5 N 的负荷。电路破裂前最大伸长率下的杨氏模量（E）为 1.67 GPa。肌腱的杨氏模量约为 1 GPa，被动拉伸肌肉的杨氏模量为 10 kPa(28)。通过扫描电子显微镜（SEM）观察金迹，在使用单轴负荷应变进行最大屈曲后，MEA 仍能导电，没有发现金属开裂的迹象（图 1F）。

3.2 治疗效果

我们确定了使用 MEA 装置刺激肌肉以防止变性肌肉萎缩和乙酰胆碱受体退化的治疗效果。在对五只 Lewis 大鼠的腓肠肌进行 1.5-3 厘米段的胫神经临界切除后，沿腓肠肌表面植入了五个 MEA 装置。对这五只动物进行了为期 14 天、每周五天、每天一小时的 500 mV、2 Hz 的 FES 无线刺激（图 2A）。术后 14 天对动物实施安乐死并收集肌肉。图 2B、2C 和表 S1 显示了肌肉纤维横截面积的治疗结果。对三种情况进行了量化： 1）未使用 MEA 进行 FES（“去神经支配”）；2）使用 MEA 进行 FES 的去神经支配肌肉（“去神经支配 + MEA”）；3）未使用 FES 的完整神经（“对照组”）。肌纤维染色采用了血色素和伊红（H&E）以及梅森毛状体染色法（MTS）。虽然仍低于野生型对照组，但与未受刺激的去神经支配对照组相比，经 MEA 处理的去神经支配肌肉的肌纤维横截面积确实有明显改善。与未经治疗的去神经支配动物相比，经 MEA 介导的 FES 治疗动物的肌肉纤维平均面积增加了 160%（p < 0.05）。

我们还测试了 MEA 介导的 FES 是否会导致乙酰胆碱受体的稳定，从而改善再神经支配。我们用免疫组化方法（表 S2）对肌肉进行了分析，并使用α-孟加拉毒毒素（α-BTX）标记突触后烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）。与未处理组（“去神经支配 ”组）相比，MEA介导的FES处理组的α-BTX染色颗粒面积明显增加（p < 0.05）（图2D）。

3.3 肌电图记录

对于一个完整的系统，MEA 还必须通过产生肌电图 (EMG) 来监测受试者的恢复情况。表皮电极必须监测肌肉活动，以确定适当的治疗方法。我们试图研究 MEA 在不同幅度的神经刺激下产生简单肌电图的记录能力。

在一个动物模型中，坐骨神经受到的刺激幅度不断增加： 20毫安、40毫安和60毫安，脉冲宽度为200微秒。MEA 被植入腓肠肌背侧，以监测肌肉收缩。(图 3A）。如图 3B 所示，我们能够清楚地识别发出的三个主要脉冲序列，并确定信号振幅的差异。记录轨迹显示，MEA 能够很好地记录这些体内电信号。

四、研究讨论

功能性电刺激（FES）通过电刺激代替神经运动控制，被临床用于治疗肌肉萎缩。通过兴奋-收缩耦合，每日刺激方案可上调肌纤维的蛋白质合成途径，下调蛋白质降解途径，并影响肌肉细胞外基质的重塑。此外，FES 还能明显增加可用于 NMJ 形成的 AChR 簇的数量和大小。在临床环境中，肌内电极通常会因炎症反应破坏界面组织而失效。经皮电极可消除电极穿透造成的损伤，但需要高电流水平，并可能导致不必要的神经兴奋。因此，目前还没有在神经修复过程中治疗肌肉神经支配萎缩的有效方法。此外，关于神经再生的动力学、运动再支配以及最佳电刺激模式，还需要更多的信息。因此，仍然需要一种有效、连续的接口，在不破坏组织的情况下改善对失神经肌肉的刺激，并对神经再生进行实时体内监测。

本文报道的多电极阵列集成了聚合物电极的柔韧性和分形图案金属电极的可拉伸性。该阵列的弹性特性与原生肌肉和肌腱相同，确保了更好的机械顺应性。这项基础性工作证明了 MEA 制作的可行性，成功地防止了肌肉萎缩，并减少了周围神经损伤后乙酰胆碱受体的损失。

为了实现一物两用的功能，MEA 的功能通过其记录附肌活动的能力得到了进一步扩展。通过将治疗优势与无线控制和遥测技术结合起来，该技术可实现实时更新的特定患者治疗方法。由于全面的关键性周围神经损伤治疗必须允许轴突再生穿过神经缺损的长度到达肌肉并重新支配肌肉，因此 MEA 对去神经肌肉和乙酰胆碱受体维持的益处还可以与其他技术结合起来，包括工程神经构建或神经导管。这种组合方法可能会增加成功再生到末端器官的轴突数量，从而促进神经再生以及神经损伤后的运动和感觉功能恢复。

本研究存在一些局限性。在这项概念验证研究中，该电极的结果和记录能力没有与传统（非柔性）附膜电极进行比较。未来的一项研究将包括直接比较杨氏模量、张力加载后的阻抗、体内记录能力以及异物相关炎症的遗传学和组织学标记，与没有皮诺曲线图案的电极进行比较，并与目前临床上使用的更坚硬的电极（如利弗莫尔、犹他 和密歇根电极阵列）进行比较。未来的工作重点是生物相容性和防止纤维囊的形成，以提高治疗效果和表皮记录的准确性。为实现临床转化，还将进行耐受性和安全性研究，调查在大鼠和包括猪在内的其他动物模型中的长期应用情况。

五、研究结论

利用半导体制造行业的灵感，我们开发出了一种用于附乳头植入的柔性电极阵列。与之前描述的电极不同，这里报告的概念验证多电极阵列将聚合物电极的灵活性与分形图案金属迹线结合在一起。为了防止纤维化相关问题，在制造过程中使用了聚酰亚胺和金等生物相容性材料。阵列的弹性特性与原生肌肉和肌腱相同，确保了更好的机械顺应性。我们的主要功能目标是在神经再生过程中保持肌肉力量，以便更快地从损伤中康复。在啮齿动物周围神经损伤模型中，这种阵列成功地减少了肌肉萎缩，并减轻了周围神经损伤期间神经肌肉接头的损失。与未经治疗的去神经支配动物相比，使用 MEA 介导的 FES 的去神经支配动物的肌肉纤维和神经肌肉接头面积明显增加。此外，该电极还能记录附肌电活动，从而进一步扩展了其功能。根据刺激方案，MEA 的肌电图记录可捕捉到腓肠肌收缩的强度和频率。从我们的研究结果来看，该设备的治疗和诊断能力在体内都显示出了良好的前景。有了这种双重功能的电极，我们现在就可以应用治疗性电刺激方案，并实时监测恢复过程。

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